Cơ chế phiên mã và sửa đổi sau phiên mã

1. Các RNA và đặc điểm chung của phiên mã

1.1. Sơ lược về cấu trúc các RNA

Có bốn loại ribonucleotide nối kết với nhau bằng các liên kết posphodiester tạo thành các chuỗi polypeptide của RNA. Trong thành phần base của các RNA, ngoài bốn loại cơ bản adenine (A). uracil (U), guanine (G) và cytosine (C), còn phát hiện một số kiểu base được sửa đổi phổ biến là trong các tRNA (hình 20).

 Có ba loại RNA cơ bản tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein của tế bào ở các sinh vật, đó là: RNA thông tin (messenger RNA = mRNA), RNA vận chuyển (transfer RNA = tRNA) và RNA ribosome (ribosomal RNA = rRNA). Riêng các rRNA, ở prokaryote có ba loại với các hệ số lắng (sedimentation, được đo bằng đơn vị Svedberg với ký hiệu: S) là 5S, 16S và 23S; trong khi đó ở các tế bào eukaryote có bốn loại 5S, 5,8S, 18S và 28S. Ngoài ra, trong các tế bào eukaryote còn có các RNA nhân kích thước lớn và sai khác nhau gọi là hnRNA (heterogenous nuclear RNA) vốn là tiền thân của các mRNA, các RNA nhân kích thước bé snRNA (small nuclear RNA) có mặt trong thành phần của các ezyme splicing (xem ở phần sau), và các RNA tế bào chất kích thước bé scRNA (small cytoplasmic RNA).

1.2. Đặc điểm chung của phiên mã ở prokaryote và eukaryote

            Phiên mã (transciption) là quá trình tổng hợp cac RNA khác nhau từ thông tin di truyền chứa đựng trong DNA. Trừ các gene mã hoá protein trong các operon ở vi khuẩn, nói chung, các RNA mới được tổng hợp chỉ là các bản sao sơ cấp (primary transcript) gọi là các pre-RNA. Các pre_RNA này phải trải qua một quá trình sửa đổi để trở thành các RNA trưởng thành (mature) trước khi tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein của tế bào.

Quá trình phiên mã DNA các đặc điểm chung sau đây (hình 21).

+) Diễn ra dưới tác dụng của các enzyme RNA polymerase.

+) Vùng DNA chứa gene được mở xoắn cục bộ, và chỉ một sợi đơn gọi là sợi có nghĩa (sense trand) được dùng làm khuôn (template) cho tổng hợp RNA.

+) Phản ứng tổng hợp RNA diễn ra theo nguyên tắc bổ sung và được kéo dài theo chiều 5’- 3’, ngược với chiều của sợi khuôn.

+) Nguyên liệu cho tổng hợp là bốn loại ribonucleoside triphosphate: ATP, UTP, GTP và CTP.

+) Sản phẩm của phiên mã là các RNA sợ đơn (single RNAs).

+) Sự khởi đầu và kết thúc phiên mã phụ thuộc vào các tín hiệu điều hoà là các trình tự DNA đặc thù nằm trước và sau gene được phiên mã.

+) Quá trình phiên mã có thể chia làm ba bước, vắn tắt như sau: Mở đầu (initiation) là sự tương tác giữa RNA plymerase với vùng promoter nhằm xác định sợi khuôn của gene và tổng hợp vài nucleotide; Kéo dài (elongation) là giai đoạn sinh trưởng tiếp tục của chuỗi RNA dọc theo sợi khuôn cho đến cuối gene; và kết thúc phiên mã (termination) đặc trưng bằng sự giải phóng sợi RNA và RNA polymerase ra khỏi khuôn DNA.

2. Các RNA polymerase của prokaryote và eukaryote

Ở Prokaryote, đại diện là E.coli, RNA- polymerase hoàn chỉnh (holoenzyme) là một phức hợp gồm nhân tố sigma (σ) và lõi enzyme. Nhân tố sigma (sigma factor) giúp cho RNA polymerase nhận biết và bám chặt vào promoter để có thể bắt đầu phiên mã tại vị trí chính xác, và lõi enzyme (core polymerase) đóng vai trò chính trong tổng hợp sợi RNA.

Ở Eukaryote, có ba loại RNA polymerase I, II và III với sự phân bố và chức năng chuyên hoá khác nhau đối với bộ gene nhân, như sau: RNA polymerase I ở trong hạch nhân (nucloelus) phiên mã phức hợp gene rRNA cho sản phẩm gồm các rRNA 18S, 28S và 5,8S; RNA polymerase II có trong dịch nhân (nucleoplasm) phiên mã các gene mã hoá protein cho sản phẩm là các hnRNA/mRNA và cả gene cho các kiểu snRNA (U1, U2, U4 và U5); RNA polymerase III có trong dịch nhân phiên mã các gene tRNA, rRNA 5S, và cả snRNA U6. Ngoài ra, RNA polymerase ty thể ở trong ty thể và chịu trách nhiệm tổng hợp tất cả các RNA của ty thể.

3. Các promoter ở các prokaryote và eukaryote

            Các vùng khởi động (promoter) nói chung nằm kề trước gene và có chứa các đoạn trình tự đặc thù cho phép RNA polymerase nhận biết và bám chặt vào để khởi đầu phiên mã tại vị trí chính xác trên sợi khuôn của gene. Vấn đề này tương đối phức tạp ở các eukaryote, vì vậy ở đây ta chỉ xét các promoter của các gene mã hoá protein mà không đề cập các loại promoter của các gene mã hoá các RNA khác. Các promoter của các gene mã hoá protein eukaryote và của operon vi khuẩn nói chung có cấu trúc khá tương đồng nhau. Đoạn trình tự quan trọng nhất của promoter được gọi là hộp TATA (TATA bõ) hay hộp Pribnow (Pribnow box). Đối với vi khuẩn, đó là trình tự TATAAT (hoặc tương tự như thế) nằm ở vị trí “-10”; còn đối với các gene mã hoá protein của eukaryote, đó là trình tự TATAA nằm gần vị trí “-30” và nó đặc trưng riêng cho các RNA polymerase II. (Cần lưu ý là, tất cả các đoạn tín hiệu đều được quy ước trên sợi đối khuôn của gene, vì chúng có trình tự giống như RNA được tổng hợp, chỉ khác là U thay cho T; các ký hiệu “-“ và “+” để chỉ các vị trí nằm trước và sau vị trí bắt đầu phiên mã, hay còn gọi là các yếu tố upstream và downstream).

Ngoài ra, trong các promoter vi khuẩn còn có trình tự TTGACA ở gần vị trí “3- 5”, gọi là đoạn nhận biết (recognition sequences). Đối với các gene mã hoá protein eukaryote, nằm phía trước điểm bắt đầu phiên mã chừng 75 nucleotide có trình tự GGCCAAATCT, thường được gọi là hộp CCAA (CCAAT box) - đọc là “hộp cat”; nó đóng vài trò điều hoà tốc độ phiên mã.

Nói chung, các vùng này được bảo tồn cao và đặc thù cho từng loại RNA polymerase nhất định, được gọi là các trình tự điều hoà (consensus sequences). Các đột biến thay thế base tại các hộp TATA, nghĩa là làm cho nó bớt giống với trình tự được bảo tồn (ví dụ, TATAAT → TGTAAT) do đó sẽ làm yếu khả năng phiên mã của promoter, gọi là down mutation. Ngược lại, các đột biến làm cho các trình tự promoter trở nên giống với các trình tự điều hoà (ví dụ, TATCTT → TATAAT), sẽ làm mạnh khả năng phiên mã của promoter, gọi là up mutation.

4. Các gia đoạn của quá trình phiên mã

Ở đây chỉ đề cập một mô hình đơn giản về quá trình phiên mã ở E.coli.

- Giai đoạn bám và khởi đầu: Sau khi RNA polymerase holoenzyme nhận biết và bám chặt vào promoter, làm tháo xoắn một đoạn chừng 12 cặp base tại đây. Sau khi tổng hợp được một vài nucleotide, nhân tố sigma tách ra để đi vào một chu kỳ phiên mã khác, gọi là chu kỳ sigma (sigma cycle).

- Giai đoạn kéo dài: Enzyme lõi tiến hành kéo dài sợi RNA dọc theo sợi khuôn. RNA polymerase lõi tiến đến đâu thì DNA được mở xoắn và phiên mã đến đấy; và vùng DNA đã được phiên mã đóng xoắn trở lại.

- Giai đoạn kết thúc: Khi quá trình phiên mã tổng hợp xong hai đoạn kết thúc giàu GC và AT nằm đằng sau gene thì tại vùng đuôi sợi RNA hình thành cấu trúc “nút cài tóc” làm dừng sự phiên mã của lõi RNA polymerase. Sau đó, dưới tác dụng của nhân tốt rho (ρ) có bản chất protein, sợi RNA vừa được tổng hợp và enzyme lõi được giải phóng ra khỏi DNA khuôn.

5. Sự sửa đổi sau phiên mã đối với các mRNA eukaryote

            Như đã đề cập, trừ mRNA prokaryote ra, tất cả các RNA còn lại dù ở prokaryote hay eukaryote đều phải trải qua quá trình sửa đổi sau phiên mã với rất nhiều cơ chế tinh vi và phức tạp khác nhau để tạo ra các RNA trưởng thành tham gia vào quá trình dịch mã; ở eukaryote, các quá trình này xảy ra trong nhân. Để có cái nhìn hệ thống, ở đây ta hãy tìm hiểu một ít về các cơ chế hoàn thiện các bản sao sơ cấp mRNA (pre-mRNA) ở các tế bào eukaryote.

5.1. Gắn thêm “mũ” m7Gppp và “đuôi” poly (A)

Để trở thành phân tử mRNA trưởng thành trước khi đi ra tế bào chất làm khuôn cho dịch mã, tất cả các pre-mRNA của các gene mã hoá protein khác nhau ở tế bào eukaryote, đều được lắp thên cái “chóp” 7-methylguanosinetriphosphate (m⁷Gppp cap) vào đầu 5’ và “đuôi” poly(A) và đầu 3’ (Hình 3.14). Đối với các gene mã hoá protein có vùng mã hoá là liên tục (không bị gián đoạn bởi các exon) như các gene histone chẳng hạn, quá trình hoàn thiện mRNA dừng lại ở đây. Loại này chiếm khoảng 10%.

Hình 3.14. Cấu trúc điển hình của một mRNA trưởng thành ở eukaryote

            Cần lưu ý rằng, ở đầu 3’ của hầu hết các gene mã hoá protein eukaryote có chứa trình tự AATAAA đóng vai trò là tín hiệu cho việc gắn “đuôi” poly(A) vào đầu 3’ của mRNA. Sự phiên mã thông thường vẫn còn tiếp diễn sau khi đi qua vị trí polyadenyl hoá này. Trình tự tương ứng ở vùng cuối 3’ mRNA được phiên mã là AAUAAA báo hiệu cho endonuclease nhận biết và cắt chuỗi RNA tại một điểm xác định nằm sau nó khoảng 10-30 base. Sau đó, một enzyme khác là poly(A)-polymerase sẽ lắp thêm vào đầu 3’ của mRNA một dãy adenine dài khoảng 150-200 base gọi là đuôi poly-A. Đuôi poly(A) có chức năng bảo vệ mRNA khỏi bị suy thoái và trong nhiều trường hợp nó còn kích thích sự dịch mã.

5.2. Sự cắt-nối đối với pre-mRNA của các gene phân đoạn (split gene)

Ví dụ, gene ovalbumin gồm bảy intron xen kẻ giữa tám exon có độ dài 7.700 cặp base đã được E.Chambon phân tích trình tự năm 1981. Sau khi enzyme splicing cắt bỏ các intron và nối tất cả các exon trong một quá trình gọi là xử lý RNA (RNA processing) thì mRNA trưởng thành có vùng mã hoá protein dài 1.872 base. Việc lý giải cơ chế cắt-nối (splicing) trong quá trình xử lý pre-mRNA dựa chủ yếu trên hai sự kiện sau: (i) Ở hai đầu mút của mỗi intron có hai nucleotide rất ổn định, gọi là các “trình tự chuẩn”, đó là 5’-GU......AG-3’. Mỗi intron nói chung có độ dài khoảng 10² – 10⁴ nucleotide; và (2) Ở một số snRNA chứa trong thành phần của enzyme splicing cũng có các trình tự dinucleotide bổ sung với các trình tự chuẩn trong itron. snRNA trong phức hợp snRNP (small nuclear ribunucleoprotein) tương tác với các đầu mút của mỗi intron, kéo hai đầu mút xích lại gần nhau tạo ra cấu trúc hình vòng, nhờ đó enzyme tiến hành cắt bỏ intron và nối các exon lại với nhau (hình 22).

Vấn đề đặt ra là sự có mặt của các intron trong cistron ác gene phân đoạn như thế có ý nghĩa gì? Bởi vì với lối tổ chức như vậy làm cho trình tự mã hoá của gene bị gián đoạn, và trong quá trình chế biến pre-mRNA của nó có thể xảy ra dù là một sai sót nhỏ cũng đủ để tạo ra mRNA có khung đọc mã bị thay đổi. Người ta cho rằng có khoảng 90% bản sao mRNA bị suy thoái và chỉ để lại khoảng 10% mRNA trưởng thành đi ra tế bào chất.

Theo quan niệm hiện nay, sự có mặt của các intron trong các gene phân đoạn có thể có các vai trò sau” (i) các intron như là các đoạn đệm (spacer) tạo thuận lợi cho sự tái tổ hợp giữa các exon bên trong gene; (ii) các intron như là các vùng đệm tách biệt các vùng chức năng của một số protein; và (iii) các intron như là các vùng phân cách cho phép các exon có thể được cắt-nối có chọn lọc (alternative splicing) để tạo ra các mRNA trưởng thành khác nhau và dịch mã thành các polypeptide khách nhau từ một gene; như đã nói trước đây, con đường cắt-nối này mang tính đặc thù cho từng mô ở các eukaryote bậc cao.